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項(xiàng)目介紹

利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，研究蛋白質(zhì)在不同生理狀態(tài)、疾病階段的表達(dá)量變化，篩選差異蛋白表達(dá)譜，尋找生物體在生理刺激、調(diào)控途徑中發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，對(duì)其功能進(jìn)行探究，是蛋白質(zhì)組學(xué)的核心內(nèi)容。

一、 ITRAQ標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析

iTRAQ (Isobaric tag for relative and absolutequantitation, iTRAQ)是由AB SCIEX公司研發(fā)的一種體外同重同位素標(biāo)記的相對(duì)與絕對(duì)定量技術(shù)。該技術(shù)利用4種或8種不同簽的同位素試劑特異性地標(biāo)記不同樣品中的蛋白多肽氨基基團(tuán)，標(biāo)記的樣品等量混勻后，經(jīng)液相色譜分離及串聯(lián)質(zhì)譜（MS/M）分析，可同時(shí)比較4種或8種不同樣品中蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量信息，通過生物信息學(xué)分析即可鑒定出所測(cè)蛋白及其在各樣品中的表達(dá)差異。

iTRAQ試劑由三部分組成：

報(bào)告基團(tuán)、質(zhì)量平衡基團(tuán)和反應(yīng)標(biāo)記試劑基團(tuán)，形成種或8種相對(duì)分子質(zhì)量均等量（145或305）的異位標(biāo)簽iTRAQ試劑用于標(biāo)記酶解后的肽段。在質(zhì)譜中，任何一種iTRAQ試劑標(biāo)記的不同樣本中的同一肽段表現(xiàn)為相同的質(zhì)荷比。在串聯(lián)質(zhì)譜中，報(bào)告基團(tuán)、質(zhì)量平衡基團(tuán)和多反應(yīng)基團(tuán)之間的鍵斷裂，質(zhì)量平衡基團(tuán)丟失，帶不同同位素標(biāo)簽的同一多肽產(chǎn)生不同的報(bào)告離子，根據(jù)報(bào)告離子的信號(hào)強(qiáng)度可獲得樣品間相同肽段的定量信息，再經(jīng)過軟件處理得到蛋白質(zhì)的定量信息。

技術(shù)特點(diǎn)

1、靈敏度高：可檢測(cè)出較低豐度蛋白，胞漿蛋白、膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白等；

2、分離能力強(qiáng)：可分離出酸/堿性蛋白，小于10K或大于200K的蛋白、難溶性蛋白；

3、高通量：可同時(shí)對(duì)8個(gè)樣本進(jìn)行分析，特別適用于采用多種處理方式或來自多個(gè)處理時(shí)間的樣本的差異蛋白分析；

4、結(jié)果可靠準(zhǔn)確：定性與定量同步進(jìn)行，同時(shí)得出鑒定和定量結(jié)果，重復(fù)樣品間的蛋白表達(dá)量相關(guān)性可達(dá)到0.95以上；

5、兼容性高：標(biāo)記所有的肽段，包括翻譯后修飾，提高了蛋白質(zhì)組的覆蓋率，而且提高了鑒定和定量的可信度。

ITRAQ 標(biāo)記定量流程

二、TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析

TMT?（Tandem Mass Tag?）技術(shù)是由美國(guó)Thermo Scientific公司研發(fā)的一種多肽體外標(biāo)記技術(shù)。TMT與iTRAQ試劑在結(jié)構(gòu)和檢測(cè)原理上基本類似，也是由報(bào)告基團(tuán)、平衡基團(tuán)和肽反應(yīng)基團(tuán)三部分組成。該技術(shù)采用2種、6種或10種同位素的標(biāo)簽，通過特異性標(biāo)記多肽的氨基基團(tuán)，然后進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析，可同時(shí)比較2組、6組或10組不同樣品中蛋白質(zhì)的相對(duì)含量。其技術(shù)特點(diǎn)與iTRAQ類似。

三、LABEL-FREE 非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析

四、SILAC定量蛋白質(zhì)組學(xué)

細(xì)胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)，利用含輕、中或重型同位素標(biāo)記的必需氨基酸（主要是Lys和Arg）培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，來標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)新合成的蛋白質(zhì)，一般培養(yǎng)5-6代，細(xì)胞中的蛋白質(zhì)將都被同位素標(biāo)記。不同處理的蛋白樣品等量混合，經(jīng)SDS-PAGE分離，切膠，酶消化，LC-MS/MS分析即可得到有關(guān)蛋白的定量及定性結(jié)果。 SILAC在比較蛋白質(zhì)組學(xué)，蛋白與蛋白互作，蛋白與DNA互作，蛋白與RNA互作等研究領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用。

1、高通量，可同時(shí)標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的蛋白，與質(zhì)譜聯(lián)用可同時(shí)分析鑒定多種蛋白；

2、同位素標(biāo)記效率高、穩(wěn)定，不受裂解液影響，結(jié)果重復(fù)性好，可信度高；

3、靈敏度高，實(shí)驗(yàn)所需蛋白量明顯減少；

4、體內(nèi)標(biāo)記，結(jié)果更接近真實(shí)生理狀態(tài)。