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    項(xiàng)目介紹

    檢測(cè)各類樣品,如動(dòng)植物組織、細(xì)胞液、全血等樣品中目標(biāo)基因的存在以及相對(duì)含量。

    實(shí)驗(yàn)流程:取材-RNA提取-測(cè)濃度-逆轉(zhuǎn)錄成cDNA-qPCR檢測(cè)-數(shù)據(jù)分析-發(fā)報(bào)告

    樣品要求

    1. 請(qǐng)?zhí)峁┮阎娜L(zhǎng)基因序列和詳細(xì)背景資料:DNA/RNA來(lái)源,豐度;

    2. 請(qǐng)您提供新鮮的且盡量多的材料,或直接提供純化好的總RNA或DNA(大于5ug/樣本)。

    3. 動(dòng)物組織:樣本離體應(yīng)當(dāng)立即放入液氮或-80℃冰箱中速凍保存,避免反復(fù)凍融,并且樣本在-80℃的保存時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng),若保存時(shí)間超過(guò)半年應(yīng)及時(shí)與工作人員取得聯(lián)系,組織寄送100mg以上,脂肪組織,結(jié)締組織,纖維化組織適當(dāng)增加,干冰運(yùn)輸;

    4.植物:新鮮的葉、果肉、種子等最少需100mg,干冰運(yùn)輸。

    5.細(xì)胞:1×10^6個(gè)細(xì)胞,加入trizol的細(xì)胞樣本(不要直接運(yùn)輸加trizol的細(xì)胞培養(yǎng)皿),Trizol 為裂解液,不適用于組織樣本的保存,細(xì)胞除外,干冰運(yùn)輸;

    6.全血:最少1 mL新鮮血液EDTA抗凝管,4度運(yùn)輸; 血清:最少1 mL,干冰運(yùn)輸;

    7.RNA樣品: OD260/280為1.8-2.0,濃度≥100 ng/μL,體積≥20μL,干冰運(yùn)輸;cDNA:cDNA原液≥20 μL,干冰運(yùn)輸;

    8. 對(duì)于完成實(shí)驗(yàn)后,剩余樣本需要返還的項(xiàng)目,需在收到項(xiàng)目完整版結(jié)題報(bào)告一個(gè)月內(nèi)告知公司,逾期樣本將安排清理。如果樣本特別珍貴,需提前說(shuō)明。一般情況下,樣本不予返還;樣本返回需要客戶承擔(dān)返還費(fèi)用(包括干冰費(fèi)和快遞費(fèi))。


    注意事項(xiàng):在裝樣品的EP管上面做好標(biāo)記,并且樣本命名應(yīng)與《項(xiàng)目送樣單》保持一致,并在送樣時(shí)用密封袋裝好;因樣本試提取或檢測(cè)均會(huì)消耗部分樣本,所以送樣樣本量需至少高于上述提及樣本量的三分之一,建議所有樣本均做好備份;

    項(xiàng)目案列

    內(nèi)參基因ACTIN(擴(kuò)增曲線)

    內(nèi)參基因ACTIN(溶解曲線)

    內(nèi)參基因COL1(擴(kuò)增曲線)

    內(nèi)參基因COL1(溶解曲線)

    COL1目的基因組柱狀圖

    常見(jiàn)問(wèn)題

    1.無(wú)Ct值出現(xiàn)

    檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤:一般SybrGreen法采用72℃延伸時(shí)采集,Taqman法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸結(jié)束采集信號(hào)。

    1、引物或探針降解:可通過(guò)PAGE電泳檢測(cè)其完整性。

    2、模板量不足:對(duì)未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起。

    3、模板降解:避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況。

    2.Ct值出現(xiàn)過(guò)晚(Ct>38)

    1、擴(kuò)增效率低:反應(yīng)條件不夠優(yōu)化。設(shè)計(jì)更好的引物或探針;改用三步法進(jìn)行反應(yīng);適當(dāng)降低退火溫度;增加鎂離子濃度等。

    2、PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足。

    3、PCR產(chǎn)物太長(zhǎng):一般采用80-150bp的產(chǎn)物長(zhǎng)度。

    3.溶解曲線不止一個(gè)主峰

    1、引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化:應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。

    2、引物濃度不佳:適當(dāng)降低引物的濃度,并注意上下游引物的濃度配比。

    3、鎂離子濃度過(guò)高:適當(dāng)降低鎂離子濃度,或選擇更合適的mix試劑盒。

    4、模板有基因組的污染:RNA提取過(guò)程中避免基因組DNA的引入,或通過(guò)引物設(shè)計(jì)避免非特異擴(kuò)增。

    4.擴(kuò)增效率低

    1、反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解。

    2、反應(yīng)條件不夠優(yōu)化:可適當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴(kuò)增法。

    3、反應(yīng)體系中有PCR反應(yīng)抑制物:一般是加入模板時(shí)所引入,應(yīng)先把模板適度稀釋,再加入反應(yīng)體系中,減少抑制物的影響。

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