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    項目介紹

    生物透射電鏡介紹:透射電鏡,即透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscope,簡稱 TEM),是一種最高分辨率可達到0.1-0.2納米的顯微鏡,是觀察和研究超微結(jié)構(gòu)的重要工具。在生物科學研究方面,透射電鏡可用來觀察細胞整體結(jié)構(gòu)、細胞亞細胞結(jié)構(gòu),包括(植物)細胞壁、細胞膜、細胞核和各種細胞器的變化、外源物質(zhì)(如病原微生物、各種納米顆粒)與細胞的關系,如外源物質(zhì)進入細胞內(nèi)部的方式、在細胞內(nèi)的分布情況、細胞對外界刺激的反應(包括自噬、凋亡、壞死等)。

    1. 主要用于生物樣品(細胞,生物組織)材料內(nèi)部形貌的分析和研究;

    2. 對樣品進行包埋,超薄切片,染色等工序,制成TEM樣品;

    3. 通過透射電鏡觀察樣品內(nèi)部的組織形貌。

    預約前請務必閱讀

    前處理方法:

    您需要提供的樣品:收集細胞/組織取樣(新鮮迅速取材),置于1.5ml尖底離心管內(nèi),加入預冷的終濃度為2.5%的戊二醛和2%多聚甲醛固定液(固定液加到?離心管,使樣品完全浸沒在固定液中),放置于4℃過夜,請不要倒棄固定液,一般固定12h或過夜后可寄送。

    具體取材及固定方法如下:

    1.對于細胞類,106以上的細胞,用新鮮的培養(yǎng)液興奮細胞,用細胞刮刀刮下來或者酶消化,加入預冷的終濃度為2.5%的戊二醛和2%多聚甲醛溶液,固定半小時,1500-3000轉(zhuǎn)離心,5-10min,收集細胞于管底肉眼可見黃豆或者綠豆粒大小,棄上清,沿管壁緩慢加入4℃新的固定液,然后放入4°C冰箱過夜。

    2.對于組織類,新鮮取材,取材位置準確,組織大小盡量在1-2mm3(長1-5mm×寬1mm×高1mm),離體取材后請盡快投入4℃預冷的固定液中,然后放入4°C冰箱固定過夜。

    3.對于細菌類,吸取OD0.5-0.8的培養(yǎng)物,加入預冷的終濃度為2.5%的戊二醛和2%多聚甲醛溶液,固定半小時,3000-5000轉(zhuǎn)離心,5-10min,離心后棄上清,收集菌體沉淀于管底黃豆大小,可以用預冷的pH7.2的PB洗1-2次,棄上清,沿管壁緩慢加入新的4℃預冷的固定液,然后放入4°C冰箱過夜。

    樣本編號建議按照字母或數(shù)字來,標記清晰,樣本量充足。

    *固定液的量請參考上圖,加至箭頭所示位置,細胞、細菌、真菌樣品用尖底離心管

    *如為其他特殊樣品,需要特殊的固定方式和前處理方式,請與工作人員溝通確認。

    樣品要求

    1. 樣品需要用戊二醛固定,一般固定2小時即可冰袋運輸(特殊樣品需要固定時間長一些),戊二醛的量要多,樣品管保留一定量的空氣。

    2. EP管用封口膜封好(防止管口漏液),EP管外用泡沫包好,避免低溫冰凍造成樣品結(jié)冰。

    3. 樣品中固體含量至少一顆芝麻粒大小,細胞和菌類要米粒大小;生物新鮮組織樣品取材到相應濃度的戊二醛固定液里,不益超過1min,以便較少自融,戊二醛需要預冷4-10℃再使用;

    4. 一般送樣方式為4℃冰袋冷藏運輸,冷凍送樣需要在訂單中特別指明。

    5. 該項目不支持回收,請自行留樣。

    6. 可測試細菌、細胞、生物組織等樣品。

    7.請盡量注明圖片標尺或具體需要拍攝的內(nèi)容,可輸出10um、5um、2um、1um、500nm、200nm和100nm的標尺;如未注明,實驗室不接受因標尺問題導致的免費補拍或重拍。

    項目案列

    TEM觀察納米顆粒在細胞內(nèi)具體的結(jié)合位點

    銹菌的TEM圖

    動物組織的TEM圖

    某細菌的TEM圖

    常見問題

    為什么通過光鏡(免疫熒光等)和分子實驗(ELISA/WB等)觀察到自噬、凋亡等現(xiàn)象,摸索出信號最強的時間點取材,結(jié)果電鏡下細胞不是結(jié)構(gòu)爛就是沒有期待的結(jié)構(gòu)呢?可能的原因有哪些?

    答:光鏡和分子水平的變化與超微結(jié)構(gòu)變化不完全平行!是基本上從來都不準確同步的,所以已經(jīng)做了其他實驗后想來看自噬和凋亡的,不一定能看到,鐵死亡、外泌體等都有這個問題。

    可能的原因有:

    1.光鏡分辨率不夠,看上去陽性的東西,可能根本不在預期結(jié)構(gòu)上。比如,線粒體相關的某標記物,光鏡下看到胞質(zhì)里陽性顆粒很多了,結(jié)果電鏡下完全沒有。精細實驗后發(fā)現(xiàn)標記的其實是某些溶酶體。

     2.生理或病理過程本身的原因。比如有老師來看凋亡,給了熒光照片,胞核標記物超級清楚,結(jié)果電鏡下細胞很爛。也有給了WB結(jié)果,選的陽性最強的時段取材,結(jié)果電鏡下細胞完好。他們都是同一板細胞分取的??赡芊肿咏Y(jié)果反映的是表達沒有,表達了不見得正在發(fā)揮作用,形態(tài)還是好的。熒光都看到了,那細胞崩裂已經(jīng)開始,鏡下就好不了。

    動物普通組織取材、送樣

    取材原則:切薄并盡快投入固定液;注意下述要求。

    1. 請盡快固定。動物組織最好在離體后1 min內(nèi)開始固定。

    2. 非灌注的組織,厚度不超過4 mm,請用恰當方式(比如切寬薄片)體現(xiàn)位置和層次關系。盡量不要事先切成很小的顆粒。

    3. 請用鋒利薄刀片切組織,朝一個方向劃,不要來回切割,不要擠壓、拉扯。

    4. 含有食物殘渣(如消化道)、大量血液(如心?。┗蚱渌じ轿铮ㄈ缛橄俚龋┑慕M織,請用生理鹽水快速漂洗,再投入固定液。

    5. 請保證固定液量充足。固定液和組織的體積比不小于20 : 1。

    6. 最初的30 min以后,最好在4 ℃的固定液中浸泡,嚴禁結(jié)冰(太靠近冰箱后壁或冰袋運輸都可能使組織結(jié)冰。冬季寧可常溫送樣)。

    備注:

    (1)組織尺寸和容器關系(只裝一個的參考標準):

    芝麻到綠豆大?。ㄈ缧∈竽I上腺):請用1.5 ml EP管;

    黃豆大?。ㄐ∈竽I臟):請用5 ml離心管;

    鋪展面積類似蠶豆大小的組織片:請用平底的25 ml廣口瓶;

    (2)每個容器含有N個組織時:容器體積要適當增大,組織不要相互擠壓變形。

    培養(yǎng)細胞常規(guī)簡易取材、送樣?

    1. 最好刮取細胞,收集在離心管中,1500 rpm離心5 ~ 10 min(該參數(shù)可按自己的經(jīng)驗調(diào)整,目的是不損傷細胞結(jié)構(gòu)的情況下去掉培養(yǎng)液成分)。

    2. 棄上清,加入固定液重懸細胞。

    3. 細胞懸液盡快(1分鐘內(nèi),久了離心難以緊固)轉(zhuǎn)移至1.5 ml尖底EP管,立即以10000 r/min離心12 min(該參數(shù)適用于一般小型臺式離心機,不可隨意更改,務必使細胞離緊不散);離緊后的細胞約半顆綠豆大小,切不可太大。

    4. 靜置15 min,然后小心棄上清,再沿管壁緩慢加入室溫或4 ℃固定液(不可沖擊、吹散細胞)。

    5. 在4 ℃保存或運輸。嚴禁結(jié)冰(太靠近冰箱后壁或冰袋運輸都可能使組織結(jié)冰。冬季寧可常溫送樣)。

    備注:

    (1)對細胞表面結(jié)構(gòu)沒有特殊觀察要求的動物細胞,均可按本法操作,比如精子、血液、脫落細胞等。薄壁細菌也可按本法處理。

    (2)觀察細胞連接的實驗,嚴禁用消化的方法收集細胞。

    (3)不耐受高速離心的樣品,請以懸液送樣。盡可能裝滿,以減少運輸途中的震蕩。

    (4)厚壁真菌等離心緊固后不易滲透的樣品,也請以懸液送樣,要求同上。

    固定液類型及介紹?

    大多數(shù)動物組織和培養(yǎng)細胞,提供2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液。專門觀察神經(jīng)髓鞘的,提供3%戊二醛+Plus輔劑(臨用前5 min內(nèi)混合);觀察厚壁真菌或細菌芽孢等,提供K-T固定液。具體根據(jù)樣本類型選擇合適的固定液,并非完全統(tǒng)一。

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